恙虫病实验室检测规范专家共识2023
恙虫病实验室检测规范专家共识
恙虫病，又名丛林斑疹伤寒，是主要经恙螨幼虫叮咬传播，由恙虫病东方体（Orientia tsutsugamushi）感染引起的，并以发热、焦痂或溃疡、淋巴结肿大及皮疹为主要临床特征的一种自然疫源性疾病，主要流行于东亚和东南亚地区。恙虫病的临床症状不典型，很容易被误诊和漏诊。中国医药生物技术协会生物诊断技术分会和中国微生物学会人兽共患病病原学专业委员会的专家学者参考国际相关指南，梳理国内外恙虫病精确、快速实验室检测相关进展，总结经验，形成了本共识。旨在明确实验室检测在恙虫病确诊方面的作用，为恙虫病的早期精准和快速实验室诊断提供支持，从而为临床医生及时使用有效抗生素干预治疗和预防并发症提供有益帮助。
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1 前言
恙虫病，又名丛林斑疹伤寒（scrub typhus 或 tsutsugamushi disease），是一种由恙虫病东方体（Orientia tsutsugamushi）感染引起、经恙螨幼虫叮咬传播的自然疫源性疾病。恙虫病的潜伏期通常为 6 ~ 21 d，以高热、皮疹、特征性焦痂、淋巴结肿大为典型临床特征；非特异性症状包括头痛、肌痛、出汗和呕吐等。恙虫病可引起多种并发症，如肝脾肿大、局灶性或弥漫性心肌炎、间质性肺炎、急性呼吸窘迫综合征、脑膜脑炎、急性肾衰竭、弥散性血管内凝血等。二战期间中缅边境抗日联军部队恙虫病的死亡率达到 8.9%~ 35.3%。在 2014 年前后，印度等东南亚国家的恙虫病住院率仍约为 9%；因治疗不当或多器官衰竭造成的死亡率达 24%。在我国，恙虫病目前不是法定传染病，监测数据不详，但根据相关文献报道，其造成的危害依然相当严重。
恙螨是恙虫病东方体的主要传播媒介，也是恙虫病东方体的储存宿主，病原体可经卵在恙螨中垂直传播。恙螨一般在灌木丛中以螨岛的形式聚集生活，当人到达其活动区域，接触后如被带菌幼虫叮咬，恙螨唾液腺中的恙虫病东方体就会释放，而进入被叮咬部位组织中，先感染内皮细胞、巨噬细胞和树突状细胞等，然后迁移至周边淋巴结，继而感染全身多个器官，导致系统性感染。
恙虫病主要流行于亚太地区，涵盖东起日本，西至阿富汗，东南至澳大利亚北部，东北至俄罗斯远东沿海地区，被称为“恙虫病三角区” 。因此，生活在亚太地区的数十亿人群存在恙虫病感染的风险。在缅甸、老挝、斯里兰卡等（亚）热带特定区域，恙虫病甚至占到急性不明发热病因的 20% 。值得注意的是，近些年新的流行区不断出现，例如，中东、非洲和南美均已发现本土恙虫病患者，保守估计，全球每年至少有一百万病例发生。在我国，恙虫病是一个古老的疾病，在公元 3 世纪就有记载。当前我国也是恙虫病重点疫区之一，在 1986 年以后疫源地陆续北扩，目前病例几乎波及全国。2016 年恙虫病病例数（21562 例）较 2006 年（1254 例）增加了 16.2 倍。随着生态环境的保护，恙虫病赖以生存的媒介和媒介寄生的宿主种群分布也趋向更加广泛，恙虫病疫区仍在不断演变和扩展，不仅对当地的公共卫生构成严重威胁，也已成为威胁各地旅游者及野外作业人员健康的重要危险因素。
临床上，恙虫感染的实验室诊断仍面临很多问题。在很多恙虫病流行地区，还不具备快速、敏感的检测条件和诊断试剂，临床医生会依据发热、焦痂和皮疹等临床表现和诊断性治疗来诊断。由于发病早期临床表现不典型，症状类似于其他急性发热性疾病，临床医生对该病的认识不足，往往会导致误诊和漏诊。而一旦漏诊误诊导致发生并发症，很可能造成患者多脏器衰竭，甚至死亡。近年来，我国二级医院和县级疾病预防控制部门的实验室检测能力都有了显著的提升，很多基层医疗机构的检测硬件和软件都有了很大的改善。因此，基于新时期条件下，开展恙虫病的早期精准和快速的实验室诊断，对于早期干预治疗、指导临床医生及时使用有效抗生素治疗和预防并发症具有非常重要的意义。
2 病原学
2.1 分类学地位
恙虫病病原体为专性胞内寄生的革兰氏阴性菌，原称恙虫病立克次体（Rickettsia tsutsugamushi），归属于立克次体属。随着研究的深入，发现该病原体的细胞壁组成、化学结构和 16S rRNA 序列等与立克次体属其他成员，如斑疹伤寒群和斑点热群立克次体均存在较大差异。1995 年将其从立克次体属中划分出来，命名为恙虫病东方体。其分类学地位为：立克次体科（Rickettsiae），东方体属（Orientia），目前属内主要的致病种为恙虫病东方体（Orientia tsutsugamushi）。此外，目前还包括 Orientia chuto 和 Candidatus Orientia chiloensis。
2.2 基因组特征
恙虫病东方体基因组大小为 1.9 ~ 2.5 Mb，Genbank 中已陆续发布来源于韩国、日本、巴布亚新几内亚、缅甸和我国患者分离菌株的全基因组序列和注释。该基因组重组事件发生频率高、基因重排严重、重复序列多。这些重复序列可占基因组的 40%，可作为分子检测恙虫病的靶标，从而实现检测灵敏度的大幅提升。
2.3 基因分型特征
恙虫病东方体菌株最早依据抗原变异（血清型）分型，但通用方案未被确定。使用临床和实验动物血清发现恙虫病东方体优势抗原主要有 4 种，分别为 56、47、21 和 110 kD 蛋白，其中 56 kD 蛋白最为重要，为型特异性抗原（type specific antigen，TSA）。56 kD TSA 在恙虫病东方体的入侵宿主细胞和宿主免疫识别方面起着重要作用，其氨基酸序列中包含保守区和 4 个高度变异的可变区，这 4 个可变区拥有优势抗原表位，可被同型别感染的临床血清所识别。依据编码 56 kD TSA 基因的高度多样性，将恙虫病东方体菌株划分成以下基因型或亚型：Gilliam、JG（日本 Gilliam）、Karp、JP-1（日本 Karp 1 型）、JP-2（日本 Karp 2 型）、Kato、Kawasaki、Kuroki、Shimokoshi 和其他未定型。56 kD TSA 基因分型系统已广泛用于流行病学研究中。
2.4 毒力特征
各型别恙虫病东方体代表株的 50% 鼠半数致死剂量研究表明：JG 亚型 Ikeda 株、Kato、JG、Gilliam和 Karp 菌株表现出对鼠的高度毒力，JP-2 是中度毒力，JP-1、Kawasaki、Kuroki 和 Shimokoshi 是低度毒力。基于多位点序列分析发现：对小鼠低毒力的菌株聚集在同一支系，而高毒力的菌株聚集在另一支系，表明存在一个对小鼠有高毒力的世系。
3 流行病学特点
3.1 宿主动物
作为一种自然疫源性疾病，恙虫病的主要宿主动物是啮齿类动物。在我国，黑线姬鼠（Apodemus agrarius）、黄毛鼠（Rattus losea）、黄胸鼠（R. flavipectus）等为主要储存宿主。其次为食虫目动物，如大麝鼩（Crocidura lasiura）和臭鼩鼱（Suncus murinus）等。此外，兔、猪、猫和禽类也能感染。
3.2 传播途径及传播媒介
恙虫病的主要传播媒介是恙螨。恙螨一生经历卵、次卵、幼虫、若蛹、若虫、成蛹和成虫 7 个时期，仅幼虫吸食宿主动物血液，跨种传播疾病。我国恙虫病的主要传播媒介包括：地理纤恙螨（Leptotrombidium deliense）、小盾纤恙螨（L. scutellare）、微红纤恙螨（L. eubellum）、高湖纤恙螨（L. gaohuense）、海岛纤恙螨（L. insularae）和吉首纤恙螨（L. jishoum）。恙螨幼虫活动范围很小，一般不超过 1 ~ 2 m，垂直距离10 ~ 20 cm，常聚集在一起呈点状分布，称为螨岛。恙虫病通过携带恙虫病东方体的恙螨幼虫叮咬传播。恙螨幼虫孵出后，在地面草丛中活动，遇到宿主动物或人时即附着其体表叮咬，3 ~ 5 d 吸饱后落于地面。常寄生在人的腰、腋窝、腹股沟、阴部等处，经常会被经验不足的临床医生忽略。人对恙虫病东方体普遍易感，流行地区居民多经感染而获得免疫，通常表现为散发。田间山野劳作的农民、野外作业人员、训练部队以及旅行者等受恙螨侵袭机会较多，容易发生感染。
3.3 流行特征
恙虫病一年四季均可发病，南方疫源地主要流行于夏季，北纬 25° 以南的广东地区全年均有流行。北方疫源地主要流行于秋冬季，流行季节与当地优势种群恙螨的最适活动时间密切相关。过渡型疫源地主要流行于秋季，发病时间具有较为典型的“10 月高发”现象。流行型别长江以北以 Kawasaki 型为主，同时存在 Karp、Gilliam 和 Ikeda 型；长江以南主要有 Karp、Gilliam 和 Kawasaki 型。新疆地区人群及动物感染恙虫病东方体基因型以 Karp 为主，可能存在与 Karp 近源的另一个新型别 Saitama 型。
4 恙虫病的实验室检测
恙虫病的实验室检测主要包括血清学检测、分子生物学检测、病原体分离培养和宏基因组测序等方面。
4.1 病史与样本采集保存
4.1.1 病史信息记录
详细记录患者个人流行病学暴露史（恙螨叮咬史、疫源地接触史）、发病时间、临床信息（发热、焦痂、皮疹、淋巴结情况等）、并发症（脾肿大、肺炎、肝功能异常、急性肾衰竭、心肌损伤）以及抗生素治疗使用情况等信息，这些信息有利于实验室检测方法的选择。
4.1.2 标本采集和保存
5 ml 枸橼酸钠或 EDTA 抗凝，采集对象：急性期（发热初期，一般发病 1 周内），尚未使用有效抗生素（如四环素类、喹诺酮类、阿奇霉素、利福平）患者，分装 2 管，尽快送检（尽可能不超过 24 h），否则应 –40 ~ –80 ℃ 保存。
2 ml 分离血清，采集对象：所有急性期病人，尤其是病程超过 1 周或使用有效抗生素已经退热的急性期患者；恢复期（尽可能间隔 2 ~ 3 周）患者。及时进行血清分离，置于 –20 ℃ 以下冰箱备检。标本采集应符合无菌操作要求。
包括脑脊液、胸腹水、肺泡灌洗液、痰液等。上述标本的运送须防污染、防振荡、冷链快速运送；标本如不能及时检测，应保存于低于 -70 ℃ 冰箱或液氮。
疑似病人入院时观察是否有焦痂，建议征得患者同意，考虑采用无菌镊剪取焦痂，可大大提高阳性检出率。
4.2 实验室检测方法
4.2.1 血清学抗体检测
利用与恙虫病东方体具有共同抗原的变形杆菌 OXK 作为抗原所进行的凝集试验称外斐氏实验。该实验简单，易操作，但因检测灵敏度和特异性较低而应用受限。
恙虫病在我国不同地域流行的优势型别有较大差别，以长江以南和长江以北的优势流行株（Karp、Gilliam、Kawasaki 和 Kato 菌株）制备混合型抗原片，使用抗原尽可能覆盖本地区流行的血清型，以期提高敏感性和检测阳性率。在急性恙虫病感染中，发病后机体产生 IgG 抗体，效价升高迅速。在发病治疗 4 个月后 IgG 抗体有较大程度降低甚至消失，维持时间短。IgM 抗体1:80 阳性，或病人恢复期血清较急性期血清 IgG 抗体滴度升高 ≥ 4 倍，或单份血清 IgG 抗体滴度 ≥1:512，可诊断为恙虫病东方体现症感染。IgM 抗体易受类风湿因子和发热期血清中其他因子的干扰而出现假阳性结果，使用单一恙虫病东方体血清型感染的细胞作为抗原时，有漏检的可能，结果观测需要较昂贵荧光显微镜和有经验的人员进行解读，制约其广泛使用。因此，IFA 更适合应用于回顾性诊断和血清流行病学调查。
ELISA 最初使用裂解的恙虫病东方体菌体或重组表达的 56 kD TSA 蛋白作为包被抗原，检测血清 IgM 和 IgG 抗体滴度。因其同样存在因恙虫病东方体多血清型别造成漏检的弊病，近年来为扩大抗原谱，使用源于多型恙虫病东方体的 56 kD TSA 蛋白作为混合抗原或嵌合抗原，获得很好的检测敏感性和特异性。虽然 ELISA 简单、易用、结果客观，但由于各流行区域的血清抗体的本底不同，各区域的检测阈值不易设定。
GICA 提供一种快速、简单的血清学检测恙虫病东方体感染的方法。多型别恙虫病东方体 56 kD TSA 作为混合抗原或嵌合抗原用于检测临床血清中抗恙虫病东方体 IgM 和 IgG，为增加检测灵敏度，21 kD 也用作检测抗原。
分子生物学检测方法以其灵敏、特异、快速、简便的优势已被广泛用于恙虫病东方体的鉴定和分型研究中。其可以在患者抗体产生前确诊恙虫病，然而受限于样本中病原体含量，只能用于辅助诊断。检测可使用全血、血浆、焦痂样本，其中焦痂样本最易检测，甚至在患者使用抗生素数天后仍能在焦痂中检测到阳性结果。目前常用的分子生物学方法（表 1）包括：普通聚合酶链式反应（PCR）、巢式 PCR、实时定量 PCR、环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）和重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymerase amplification，RPA）等。巢式 PCR、实时定量 PCR可以显著提高普通 PCR 扩增的特异度和灵敏度；而 LAMP 和 RPA 技术在保证灵敏度的同时，仅需简单的恒温控制设备并在半小时内完成检测，更加方便、经济和快捷。靶标基因的选择，临床早期诊断和恙虫病东方体感染确认为目的 PCR，引物设计建议选择热休克蛋白基因（groEL、groES）；分型鉴定 PCR，靶基因建议选择高度多样化的 56 kD 型特异性抗原基因（tsa）。迄今为止，基于 56 kD tsa 完整基因序列已经鉴定出 20 多种恙虫病东方体基因型和亚型。目前常用的靶基因还有 47 kD 蛋白基因、16S rRNA 基因和多拷贝接合转移蛋白 traD 基因。尤其是全血中恙虫病东方体载量低，使用多拷贝的 traD 基因能够提供更高的检测灵敏度。另外值得注意的是恙虫病东方体 DNA 不同于一般细菌 DNA，非常容易降解，所以样本采集、运输、DNA 提取过程必须快速、低温。
病原体分离是恙虫病感染确认最可靠的实验室诊断方法。病原培养方法包括：细胞分离培养、动物接种及鸡胚培养。常用的敏感细胞系有 L929、DH82、BHK 细胞、Vero 和 HeLa 细胞等。接种时将细胞培养形成单层，接种无菌样本，32 ~ 37 ℃ 培养，每日观察细胞病变情况。实验用豚鼠和小白鼠是恙虫病东方体分离较常用的敏感动物，采用床边腹腔接种。接种后（弱毒株需注射环磷酰胺）观察小鼠生理变化，在小鼠病重期解剖取其脾、肾等脏器。鸡胚分离时，将无菌样本接种至 7 ~ 9 日龄鸡胚的卵黄囊中培养，3 d 后取死胚进行病原体分离。接种动物脏器、细胞和鸡胚卵黄囊膜冰冻切片或涂片，利用姬姆萨染色、IFA 等方法进行检测，在荧光显微镜下观察组织中的恙虫病东方体颗粒；或通过透射电镜观察宿主细胞细胞质内的呈圆形、椭圆形、哑铃状等形态多样、大小不一、电子密度迥异的恙虫病东方体，亦可观察到恙虫病东方体的自我吞噬现象，且单核细胞的细胞核及胞质内细胞器发生多种病理改变。
mNGS 是基于高通量测序技术以及生物信息学分析对病原体进行基因测序的临床实验室诊断技术。截至目前，该技术是临床应用最广泛的病原体高通量测序技术，对临床患者感染病原体的早发现和精准治疗有着极其重要的作用。由于mNGS 是新型的病原体检测技术，对恙虫病的检测使用尚不广泛。但目前小样本的研究显示，mNGS 检测对于恙虫病的敏感性为 100%，且使用患者体液（脑脊液、胸腹水）及进行检测的拷贝数要高于使用血液标本，在发病早期（2 周以内）无典型焦痂样溃疡患者的诊断价值远高于外斐氏实验和各类血清抗体的方法。除此以外，mNGS 可以用于恙虫病东方体与其他病原体感染的迅速鉴别，对于恙虫病合并和（或）继发其他感染的诊断具有重要价值。
5 结语
由于恙虫病临床症状不典型，与其他立克次体、螺旋体等引起的感染难以鉴别，并存在多重感染，因此，建议临床诊断务必结合实验室检测，同时采用多重检测方法，检测恙虫病和其他临床症状相似的传染病及多重感染。目前，在多重核酸检测方面，针对恙虫病东方体、斑疹伤寒立克次体、斑点热立克次体和钩端螺旋体的多重 PCR 方法已初步建立，但灵敏性和特异性有待提高，标准化及商业化均急需推进。基于血清学的多重检测方法目前尚未建立，今后可使用恙虫病东方体及其他病原特异性抗原，通过斑点印迹、蛋白芯片和免疫层流等技术建立多重抗体检测技术以区分恙虫病和其他临床症状相似的传染病。这些新技术的运用势必进一步提升恙虫病感染的临床诊断能力。
引用：中国医药生物技术协会生物诊断技术分会,中国微生物学会人兽共患病病原学专业委员会.恙虫病实验室检测规范专家共识[J].中国医药生物技术,2023,18(1):87-93.
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